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    干貨丨PCR功能簡介

    更新日期:2019年2月27日 大字 小字
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    年初,中國科幻電影“小破球流浪地球”持續熱映,片中洗腦循環的經典臺詞讓觀眾會心一笑,小寶覺得這句話用在科研界一樣適用:新手除了了解基本的實驗操作原理及步驟之外,還應對實驗儀器有大致的認知,能夠讓儀器輔助實驗順利進行。


    在初次接觸PCR儀時,小白們都會有各種各樣的困惑。譬如:PCR儀上的熱蓋和PCR管蓋作用一樣嗎?,不同品牌的熱蓋都是一樣的嗎?熱啟動又是什么意義?兩個加熱模式哪種情景適用?帶著這些問題,小寶給大家一一解答!

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    眾所周知,PCR儀又稱熱循環儀,是配合PCR過程的專用變溫儀器,熱蓋是儀器上方的一部分,用來免樣品在高溫環境下蒸發冷凝在管蓋上而減少反應樣品體積的風險。

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    PCR又稱聚合酶鏈反應,是體外擴增目的DNA片段的方法,在多方面廣泛應用,主要分為三大步驟:高溫變性、低溫退火、適溫延伸。分別添加引物、模板、Taq酶、dNTP和緩沖液等反應物混合,在約為95℃環境下,雙鏈DNA氫鍵斷裂解旋為單鏈;單鏈與人工設計的引物在約為60℃溫度下,按照堿基互補配對的原則相結合;并升溫到72℃左右,利用Taq酶延伸合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。

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    在此過程中,某段溫度會接近或高于100℃,部分樣品會隨著高溫向上蒸發,遇上溫度較低的PCR管蓋,則會冷凝在管蓋上,管內的樣品就會有一定損失,少一部分沒有參加循環,造成樣品得率降低。

    在此之前儀器還不具備這個裝置,是通過樣品里滴加石蠟油來解決此問題的,但實際上后續對石蠟油的處理較為繁瑣。后續熱蓋的出現能夠有效避免該風險,熱蓋的溫度一般都會比模塊高5-10℃,這樣模塊內的PCR管上端溫度始終大于反應液的溫度,由于高溫處壓強大于低溫處壓強,液體不會向上蒸發,于是所有的樣品反應液體積不會發生變化。

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    但由于樣品管的高度不一,早期的儀器不可調熱蓋只能用于統一高度的樣品管,當使用較矮的樣品管時,需要加入鋁塊,較為麻煩;目前可調式熱蓋分為旋鈕式自調節式等:有些儀器旋鈕式熱蓋的高度和壓力是根據樣品管可調整:但換樣之前需要將旋鈕旋回原位。并且存在壓力不好控制的問題:過緊會使樣品管變性等;過松則無法達到相應溫度影響結果。自調節則可根據樣品管高低調節高度。



    所謂熱啟動則是在樣品管中添加的Taq酶用于適溫延伸這一步驟,但往往在室溫的環境下,Taq酶也能發揮作用,因此在加反應物或是高溫變性前,都需要防止Taq酶在非適當溫度下開始工作,以避免該情況下非特異性產物。模板和酶數量一定,產生非特異性的產物,這說明特異性產物含量會降低,因此,會在冰上加樣,或是先預熱PCR儀,再迅速放入PCR管。



    還可以將凝固冷卻的蠟將引物,Mg2+,dNTP,和緩沖液混合和剩余反應組分上、下層隔離開來。在變性階段,蠟受熱熔化,所有成分混合,且液態蠟浮到樣品的上部,充當熱蓋的作用,但后續蠟處理較為棘手。利用化學修飾或者制備抗原抗體復合物等方法使得其按照溫度高低控制酶活性。


    石蠟熔化示意圖(管內黃色部分為石蠟)


    面對高通量的樣品,手動熱啟動防護會十分耗時,因此,PCR儀會設定熱蓋溫度,當熱蓋加熱到一定溫度之前,模塊溫度保持不變;熱蓋溫度達到設定值時,模塊迅速升溫,達到熱啟動的效果。

    另外,很多PCR儀在加熱模式上有Tube、Block兩種方式可選。這是因為儀器的溫度傳感器在模塊下部,實際上無法測得樣品管內的溫度。一般情況(Block)下,在輸入設定溫度及運行時間時,指的是模塊在到達指定溫度下持續相應的時間,樣品管的溫度不能迅速達到指定的溫度;而Tube模式是先將模塊溫度高于設定溫度,等樣品管溫度到達指定溫度,再將模塊溫度降到指定溫度,這樣能快速使管內溫度達到設定值。不同反應體積和要求可使用不同的模式:普通PCR或體積較大使用Tube模式,當長時間保溫且對溫度過沖要求較高或是體積較小時,可以使用Block模式。


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